FerroFarRed (Fe²⁺indicator) 亞鐵離子熒光探針

產品標簽

FerroFarRed；FeRhoNox-1；FerroOrange；Labile ferrous ion 不穩定鐵(II)離子；Fe2+熒光探針Ferroptosis 鐵死亡；C11 BODIPY 581/591 脂質過氧化探針；

產品信息

產品描述

FerroFarRed，也稱為SiRhoNox-1、ER-SiRhoNox，是一種特異性檢測不穩定的鐵(II)離子（Fe2+）的熒光探針。FerroFarRed基本無熒光，一旦與Fe2+反應后，不可逆的生成一種遠紅熒光產物（Absmax=646nm，FLmax=662nm，圖1. FerroFarRed的光譜特征）。生理濃度下的鐵（III）離子（Fe3+）或其它除鐵離子以外的二價金屬離子都不會使其熒光增強（見圖2. FerroFarRed的金屬離子反應特異性）。FerroFarRed具細胞膜滲透性和高選擇性，且在高達100μM的濃度下對細胞幾乎無毒性，適用于活細胞內Fe2+的檢測，傾向定位在內質網（ER）。適用于熒光顯微鏡、共聚焦顯微鏡、熒光酶標儀以及流式細胞儀（配置紅色激光器）分析。

圖1.FerroFarRed的光譜特征。FerroFarRed在0.05M HEPES buffer，pH 7.4下的吸收光譜（左）和熒光光譜（右）。FerroFarRed的吸收波長在646nm，而熒光波長在662nm。

圖2.FerroFarRed的金屬離子反應特異性。FerroFarRed（5 μM）與各種金屬離子反應后，用熒光酶標儀測定熒光強度（激發波長：630nm，發射波長665nm）。可見，僅與Fe2+反應后發生顯著的熒光增強。

保存與運輸方法

保存：≤-20℃避光干燥保存，至少1年有效。

運輸：冰袋運輸。

注意事項

1）   FerroFarRed傾向定位在內質網，但也可能檢測細胞質池內的Fe2+，目前針對這一點未做明確評估。

2）   熒光染料均存在淬滅問題，請盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。

3）   為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

使用說明

一、 需要自行準備的材料

1.1 細胞培養級或超純DMSO（比如：MS4601A-100ML）【強烈建議將高純的DMSO分裝成單次用量保存在極低溫冷凍室內，比如-80℃，避免吸潮。降解的DMSO可能會增加FerroFarRed的背景信號】

1.2 合適的觀察緩沖液（比如：PBS, pH 7.4；HBSS；等）。不要含酚紅。

1.3    無血清細胞培養基（D-MEM等）

二、探針準備

2.1從冰箱取出FerroFarRed，置于室溫回溫至少30min，將其置于微量離心機內低速離心。將瓶內的粉末離心到管底后，再開蓋。

2.2 往一管FerroFarRed（50nmol）內加入50μl 高質量DMSO，用槍反復吹吸5次或以上，使其完quan溶解即得到1mM FerroFarRed儲存液。【注意：FerroFarRed是藍色固體，但溶液幾乎無色（淺藍色）】。建議單次用完儲存液，若實在用不完，請根據單次用量分裝，置于-80℃避光保存。用中性緩沖液來稀釋儲存液。

三、HeLa細胞Fe2+的染色步驟（熒光成像分析）

3.1 在玻底培養皿內接種細胞，培養過夜。

3.2從培養皿內吸走培養基，用合適的觀察緩沖液（比如：HBSS）清洗兩次。

3.3 用無血清細胞培養基稀釋1uM FerroFarRed儲存液，制備成5mM的染色工作液。

3.4 將染色工作液加入培養皿內，于37℃孵育1h。

【注意：①建議根據細胞類型和自身實際需求優化工作濃度和孵育時間。②如果細胞很容易從培養皿上脫落，建議使用多聚L-賴氨酸或其它包被基質包被的培養皿來接種細胞。】

3.5 染色后用觀察緩沖液（比如：HBSS）清洗一次，替換成新的觀察緩沖液。

3.6 在熒光顯微鏡下觀察細胞。

四、HepG2細胞Fe2+的測定（流式分析）

4.1 于多孔培養板內接種細胞，過夜培養。

4.2 從培養板內吸走培養基，用合適的觀察緩沖液（比如：HBSS）輕輕的清洗兩次。

4.3 用無血清細胞培養基稀釋1uM FerroFarRed儲存液，制備成5mM的染色工作液。

4.4 將染色工作液加入培養板內，于37℃孵育1h。

【注意：建議根據細胞類型和自身實際需求優化工作濃度和孵育時間。】

4.5 染色后，用PBS清洗一次，之后加入0.25% yi酶-EDTA消化細胞。

4.6 于冰上用PBS稀釋0.25% yi酶-EDTA，之后500 x g離心細胞懸液5min，以沉淀細胞。

【注意：不可用血清來中和yi酶。】

4.7 吸走上清，用PBS重懸細胞。

4.8 用細胞篩網（40μm尼龍篩網）過濾細胞，去除細胞碎片。

4.9 上機，流式細胞儀分析。

五、熒光檢測

對于激光激發：635nm波長左右的激光器比較適合。熒光在660nm左右觀察。

對于熒光顯微鏡觀察：選擇檢測Cy5的紅色激發濾片。對于流式分析，選擇檢測APC的濾片。

相關產品

FerroFarRed的染色示例（來自文獻）

Ref 1. Li Z, Jiang L, Chew SH, et al. Carbonic anhydrase 9 confers resistance to ferroptosis/apoptosis in malignant

mesothelioma under hypoxia. Redox Biology. 2019 Sep;26:101297. DOI: 10.1016/j.redox.2019.101297. PMID:

31442913; PMCID: PMC6831888.

檢測方法（Fe(II)的細胞定位）：Catalytic Fe(II) was detected with a fluorescent turn-on probe, SiRhoNox-1 (FerroFarRed;), as previously described. Cells (5?×?104) were cultured in normoxia on 35-mm glass bottom dish  for 16?h?at 37?°C. After treatment with CA9 inhibitors under hypoxia for 48?h, cells were co-stained with 5?μM of SiRhoNox-1 and 200?nM of LysoTracker Green in FluoroBrite DMEM for 30?min?at 37?°C in normoxia, followed by incubation with 75?nM of MitoTracker Red for another 30?min. We confirmed that 1-h incubation in FluoroBrite DMEM containing 0.1?mg/L (0.25?μM) Fe(NO3)3 scarcely affects iron metabolism of the cells within this limited period. Medium was replaced with new FluoroBrite DMEM, followed by observation with a confocal microscope (LSM880, Carl Zeiss; Oberkochen, Germany). The excitation/emission used for SiRhoNox-1, LysoTracker and MitoTracker probes were 633/670, 504/511 and 579/599?nm, respectively. Local signal intensity of the regions overlapped with each organelle-trackers were analyzed with ZEN Imaging Software (Carl Zeiss).

Fig. 1  CA9 overexpression in MM cells correlates with increased catalytic Fe(II) in response to hypoxia. (F) Differential levels of catalytic Fe(II) in normoxia or hypoxia of ACC-Meso-1?cells were determined by staining with SiRhoNox-1 (5?μM), followed by evaluation with a flow cytometer after 48 h-incubation. (G) Localization of catalytic Fe(II) in normoxic or hypoxic ACC-Meso-1?cells were analyzed by co-staining of SiRhoNox-1 (5?μM), LysoTracker (200?μM) and MitoTracker (75?μM) after 48 h-incubation and observation with a confocal microscope. Integrated intensity per cell (N?=7) was quantified by ZEN Imaging Software (ZEISS) (means ± SEM; *P < 0.05, **P < 0.01, ***P<?0.001 vs each control unless indicated by bar). Refer to text for details. SM, sarcomatoid mesothelioma; EM, epithelioid mesothelioma; N, normoxia; H, hypoxia; A.U., arbitrary unit.

— —Written/Edited by V. Shallan【版權歸MKBio懋康所有】

上海懋康生物科技有限公司是一家涉足于生命科學和生物技術領域研究的試劑、儀器和實驗室消耗品與實驗服務工作，主要從事細胞生物學、植物學、分子生物學、免疫學、生物化學、蛋白組學。生物制藥與診斷試劑研發生產等領域。 本公司秉承“以人為本，以誠為信、合同守信"的經營理念。堅持"品質保障"的原則為廣大客戶提供優質產品。