Caspase-8 Activity Assay Kit (Fluorometric)

Caspase-8活性檢測試劑盒（熒光法）

產(chǎn)品信息

產(chǎn)品描述

Caspases（Cysteine-requiring Aspartate Proteases）是一個高度保守的半胱an酸蛋白酶家族，特異性識別底物中的天冬氨酸殘基，在介導細胞凋亡的過程中發(fā)揮著非常重要的作用。Caspases以潛在酶原的形式表達，通過自發(fā)蛋白分解機制或經(jīng)其他蛋白酶（通常是其他caspases）加工處理的方式被活化。人caspases可細分為三大功能組：細胞因子活化（caspase-1，-4，-5和-13），凋亡啟動（caspase-2，-8，-9和-10）和凋亡執(zhí)行（caspase-3，-6和-7）。

Caspase-8（Caspase 8），也稱為Mch5，MACH和FLICE，位于caspase級聯(lián)層次結構的頂端，是“上游"成員或caspases的啟動家族。以無活性酶原的形式存在細胞內，分子量55kDa。一旦募集到死亡受體胞漿結構域（比如Fas），通過配體蛋白FADD，即被激活，形成一個由18kDa和12kDa亞基組成的二聚體，進一步激活下游的caspases（-3，-6和-7），進而切割關鍵的細胞底物，導致細胞凋亡性死亡。

Caspase-8活性檢測試劑盒（熒光法）（Caspase-8 Activity Assay Kit, Fluorometric or Caspase-8 Fluorometric Assay Kit）以偶聯(lián)上發(fā)色基團AFC的caspase-8序列特異性的多肽為底物。當?shù)孜锉籧aspase-8剪切后，發(fā)色基團被釋放出來，進而用熒光酶標儀來測定其熒光強度（激發(fā)波長=485nm，發(fā)射波長=535nm）。通過計算RFU凋亡誘導組/RFU陰性對照組的比值來確定凋亡誘導組caspase-8的活化程度。

本品適用于培養(yǎng)細胞以及新鮮組織的caspase-8活性檢測。

產(chǎn)品包裝

保存與運輸方法

保存：-20℃保存，1年有效。開盒后置Lysis Buffer和2× Reaction Buffer于2-8℃保存。Caspase-8 Substrate和0.1M DTT需要避光凍存。

運輸：冰袋運輸。

注意事項

1） Caspase-8 Substrate需避光保存和使用。

2） 某些凋亡誘導劑誘導的凋亡可能通過caspase-8非依賴的方式進行，此種情況使用本品檢測的caspase-8活性無明顯變化，則，需要考慮凋亡機制中的其他信號通路。

3） 起始細胞數(shù)量需達3~5×10⁶個或新鮮組織量達50~100mg，以保證達到測定所需的100~200μg蛋白量。Caspase-8的活性與細胞裂解后的蛋白含量有關，如測定的RFU值偏低，可通過適當延長反應時間來操作。但如果測定的RFU值依然不高，則要通過增加細胞數(shù)量或組織量的方法來提高蛋白量。

4） 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

使用方法

1. 需要的其他試劑和材料

儀器：低溫高速離心機、熒光酶標儀、微量移液器、玻璃勻漿器（組織樣本）

耗材：1.5ml微量離心管、白色或黑色（不透明、平底）的96孔酶標板

試劑：PBS、蛋白定量試劑（比如：Bradford法蛋白濃度測定試劑盒）、ddH₂O

2. 試劑準備

2.1 Lysis Buffer（含DTT）

于實驗前，按每50μl Lysis Buffer 加入0.5μl DTT的比例準備足量的裂解工作液，置于4℃或冰上待用。

2.2 2×Reaction Buffer（含DTT）

于使用前，按每50μl 2×Reaction Buffer 加入0.5μl DTT的比例準備足量的反應工作液。

2.3 Caspase-8 Substrate工作液

將Caspase-8 Substrate從冰箱內取出，置于室溫（或25℃水?。┦蛊涑浞秩诨?，低速離心使其沉至管底。于使用前，按照19.5μl 2×Reaction Buffer 加入0.5μl Caspase-8 Substrate的比例準備足量的Caspase-8 Substrate工作液。

3. 樣本準備

3.1 細胞裂解

a）用合適方法誘導細胞凋亡，同時設立陰性對照組（不加誘導劑），收集3~5×10⁶個細胞。

b）PBS洗滌細胞2次（2000rpm，離心5min），盡量吸盡PBS上清。

c）往離心的沉淀細胞中加入100μl預冷的Lysis Buffer（含DTT），吹打混勻。

d）置冰上裂解20~60min，其間渦旋振蕩3~4次，每次10s；或凍融2~3次。

e）4℃，10,000rpm離心1min。

f）小心吸取上清（含裂解釋放的蛋白質）轉移到新的EP管內，置于冰上待用。

g）取少量上清（1~2μl），用常規(guī)方法（Bradford法）測定蛋白濃度。

3.2 組織裂解

a）取50~100mg組織置于培養(yǎng)皿內，用手術剪剪碎成3mm×3mm左右的小塊，加入150~200μl預冷的Lysis Buffer（含DTT），用玻璃勻漿器上下手動勻漿15次，注意低溫操作。

b）將組織勻漿液轉移到1.5ml預冷的離心管，10,000rpm，4℃離心5min。

c）小心吸取上清（含裂解釋放的蛋白質）轉移到新的EP管內，置于冰上待用。

d）取少量上清（1~2μl），用常規(guī)方法（Bradford法）測定蛋白濃度。

4. Caspase-8活性檢測

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